什么是考马斯亮蓝法（Bradford法），Western中考马斯亮蓝的作用是什么

bradford法测定蛋白质含量的原理是考马斯亮蓝G250与蛋白质结合可以显色，用分光光度计在吸光度595nm处读数，通过标准蛋白与G250结合显色建立标准曲线，再加待测蛋白与G250结合显色后读数代入标准曲线测定蛋白质含量。不利原因主要是特殊蛋白的结构，缓冲液组分中有干扰试剂等。

考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因为这个原因可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右时间内达到平衡，完成反应十分快速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简单方便快捷，反应很灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL是一种经常会用到的微量蛋白质迅速测定方式。 考马斯亮蓝有G250和R250两种。这当中考马斯亮蓝G250因为与蛋白质的结合反应十分快速，经常会用到来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是，可以被洗脱下去，故此，可以用来对电泳条带染色。 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程 该方式用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超越0．2％影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。 1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50m195％乙醇，加入100ml浓磷酸，然后，用蒸馏水补充至200ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。 2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽可能使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，比如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。假设待测样本是未知的，也可以用抗体作为标准蛋白。一般在20ug—150ug／100ul当中绘制标准曲线。 3．将待测样本溶于100~1缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液一样(好用PBS)。 4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如产生沉淀，过滤除去。 5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30rain。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不可以超越30min． 6．按照标准曲线计算待测样本的浓度。

马斯亮蓝染色是用考马斯亮蓝进行蛋白质染色的方式。

1 电泳结束后， 取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，保证染色液可以充分覆盖凝 胶。置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时 间。 注：详细的染色时间主要还是看凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚， 温度很低，则染色时间宜一定程度上延长。凝胶较薄，温度非常高，则染色时 间可以一定程度上缩短。一般染色至凝胶的颜色和染色液的颜色很接近， 在染色液中基本上看不清凝胶时，可以觉得已染色充分。染色2-4 个小 时或更长时间不会对后的染色效果出现不好的错误影响。

2 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3 次。

3 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，保证脱色液可以充分覆盖凝胶。 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色 4-24 小时。这个时间段更改替换脱色液2-4 次，直至蓝色背景差不多都被脱去，并且蛋白条带染 色效果达到预期。一般蛋白条带在脱色1-2 小时后就可以产生。

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量实验中，使用的水低要求是蒸馏水，更高精度要求可能会使用双蒸水。因为Bradford检测中要用的试剂配制，标准曲线的制作都要用到水。

假设不是为了让用蒸馏水，可能水里面会有一部分游离的离子或者电解质，会影响试剂配制的准确性，干扰实验结果。

而水中残留的有机物等可能会和考马斯亮蓝出现变色反应，这样制作的标准曲线会比实质上值偏高，致使后浓度检测的结果比实质上结果偏低。

琼脂糖凝胶电泳的染料有不少种,近这些年较经常会用到的有：



EB-溴乙锭,EB有很大毒性,可致癌,故此，使耗费时长一定要万分小心.EB染色的背景很强.



SYBR Green-也叫荧光绿如蓝,低毒性,但检测灵敏度没有EB高.



GelRed-号称无毒,无皮肤渗入型,有伤口就不好说了.背景荧光弱,但加多了容易产生拖带.因为在市场上价格非常高,故此，有产生不少仿冒货,买时要擦亮眼睛.

(一)标准考马斯亮蓝染色法

(1)电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮蓝R-250(溶解于百分之50甲醇和百分之10乙酸中)；

(2)室温下振摇温育4h至过夜；

(3)去除染色液，收集保存可重复使用20-40次：

(4)依次在25%甲醇和7.5%乙酸中室温振摇下脱色。灵敏度为0.1-0.5ug蛋白/每条带。注：使用加热的染色液或脱色液可以缩短染色或脱色时间。将染色液或脱色液在微波炉或水浴中加热，(大概50-60℃)，染色时间可缩短至20min,脱色时间约 1-2h。

(二)迅速考马斯亮蓝染色法

(1)电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮蓝R-250(溶解于百分之50三lv乙酸中)；

(2)室温下振摇温育20min；

(3)去除染色液，收集保存可重复使用多次；

(4)加入数倍体积的脱色液(25%甲醇、7%乙酸)室温振摇下脱色。必要时可更改替换脱色液。灵敏度为1.0ug蛋白/每条带。

(三)凝胶铵银染色法

(1)电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的百分之50乙醇和百分之10乙酸，振摇30min至过夜；

(2)去除百分之50乙醇和百分之10乙酸，用去离子水清洗凝胶。加入百分之20乙醇, 室温振摇30min；

(3)去除百分之20乙醇，再加5倍体积的百分之20乙醇，室温振摇30min；

(4)去除百分之20乙醇，将凝胶转入通风柜内，加入5倍体积的用去离子水配制的5%戊2醛，室温振摇30min；

(5)去除戊2醛，用去离子水清洗凝胶。加入5倍体积的百分之20乙醇，室温振摇20min；

(6)去除百分之20乙醇，重复（6）两次；

(7)去除百分之20乙醇，用去离子水清洗凝胶。再加入5倍体积的用去离子水，室温温育10min；

(8)去除去离子水，加入4倍体积新鲜配制的氨-水/银溶液，室温振摇30min。配制100ml：加1.4ml 14.8mol/L氢氧化铵到100ml水中，再加入190ul　10mol/L氢氧-化钠；放置涡旋器上缓缓加入1ml新鲜配制的硝-酸银溶液(0.8g硝-酸银/ml水)，直至产生沉淀物，但很快溶解；

(9)去除氨-水/银溶液，用去离子水清洗凝胶20min以上，其间更改替换水数次；

(10)去除水，加入5倍体积新鲜配制的0.005%柠檬酸，0.019%的甲醛。轻柔混匀，数分钟内条带即显现出。当背景启动变化时，去除显影剂，用用去离子水清洗凝胶。在百分之10乙酸和百分之20乙醇中温育凝胶，以终止反应。灵敏度为1－10ng蛋白/每条带。

注：操作时，应戴手套并使用洁净的玻璃器皿，避免污染，影响反应的灵敏度。

(四)凝胶中性银染色法

(1)电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的百分之30乙醇和百分之10乙酸，振摇30min至过夜；

(2)去除乙醇/乙酸溶液，加入5倍体积的百分之30乙醇, 室温振摇30min；

(3)去除乙醇，再加5倍体积的百分之30乙醇，室温振摇30min；

(4)去除乙醇，加入10倍体积的去离子水，室温振摇10min；重复用去离子水清洗两次；

(5)去除去离子水，加入4倍体积新鲜配制的0.1%硝-酸银溶液(用室温下贮存于棕色瓶内的百分之20原液稀释而得)，室温振摇30min；

(6)去除硝-酸银溶液，用去离子水清洗凝胶20s；

(7)去除水，加入5倍体积的2.5%碳酸钠和 0.02%的甲醛(pH4.0),室温振摇温育，数分钟内条带即显现出。当背景启动变黑时，停止温育；

(8)在1%乙酸内清洗，停止反映。用去离子水清洗，更改替换数次，每一次10min；灵敏度为1－10ng蛋白/每条带。

(五)凝胶铜染色法凝胶铜染色法为考马斯亮蓝或银染色法的替代染色方式

将凝胶lv化铜溶液中温育，在Tris和SDS同时存在时可形成明显的白色不透明的沉淀物。蛋白条也还是清晰，留下一个多肽分离模式的附染图象。因为蛋白质未结合在凝胶上，可以通过EDTA去除Cu离子而得以洗脱，因而该方式非常合适需迅速定位蛋白条带用于免疫反应，或进一步进行蛋白质化学研究。其染色模式如同考马斯亮蓝或银染色法的凝胶，易进行拍照。

(1)电泳后，凝胶用蒸馏水短时清洗数次，每一次30s,勿洗过长时间；

(2)将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的0.3mol/L CuCl2；

(3)室温振摇５min，较厚的凝胶可一定程度上延长时间。当CuCl2 进入凝胶时，在不含蛋白的区域出现白色沉淀；

(4)用蒸馏水清洗数分钟，在黑色背景下观察结果。灵敏度为10-100ng蛋白/每条带(0.5mm厚的凝胶)或1ug蛋白/每条带(1mm厚的凝胶)。注：将凝胶在0.25mol/L EDTA、0.25mol/L Tris溶液中温育能够让铜染逆转

有毒。

考马斯亮蓝属于三苯甲烷类染料,可与蛋白质形成很强的非共价复合体.考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；考马斯亮蓝G250是布拉德福德(Bradford)蛋白质定量试剂的主要成分。

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有大光吸收.其光吸收值与蛋白质含量成正比。

有

考马斯亮蓝为一种三苯甲烷类染料，可与蛋白质通过范德华力作用形成很强的非共价复合体。考马斯亮蓝染色法以非常高的重复性和灵敏度还有很好的质谱兼容性，成为现在一种使用较为广泛的蛋白质染色方式，其在一定范围内和蛋白浓度呈正比，因为这个原因也用于蛋白定量检测

考马斯亮蓝显色法测定植物蛋白质含量，显色反应灵敏，大吸收波长是595nm，而考马斯亮蓝的大吸收波长是488nm，不干扰测定结果。

蛋白质含量的发现早是在在18世纪，安东尼奥·弗朗索瓦和其他一部分研究者发现蛋白质是一类独特的生物分子，进行认真分析注意到的例子有来自蛋清、血液、血清白蛋白、纤维素和小麦面筋里的蛋白质，但是，却没办法进行衡量这当中的准确的比例。

　　在1838年“蛋白质”这一词才启动问世是荷兰化学家永斯·贝采利乌斯所提出的，在那个时候他们启动进行对蛋白质的对应的公式进行摸索，思维完全的初期正确的分子式，但是，得出一个比较接近的分子量为131Da。

　　再接下去的一百年时间里面，科学家则是针对一部分含有蛋白质的物品进行研究，如血液、蛋清、各自不同的毒素中的蛋白质还有消化性和代谢酶，针对纯化的蛋白质的测量则是很少的进行。

　　在1933年威廉·阿斯特伯提出了根据氢键的规则蛋白质二级结构，但是，后是由化学家莱纳斯·鲍林来进行验证的，再接下去时间里面他们启动进行进一步的研究。

　　到了1949年，弗雷德里克·桑格第一次正确地测定了胰岛素的氨基酸序列，并验证了蛋白质是由氨基酸所形成的线性（不具有分叉或其他形式）多聚体。再接下去时间里面就来是进行蛋白质的结构分析了。到了目前大家针对蛋白质的研究依然是在持续性的前进的。

粉状还有业态的物体进行蛋白质含量的测定时比较的方便只要能使用自动型凯氏定氮仪进公务员行政职业能力测验定既可，但是，假设针对固态的物体进行蛋白质含量的测定就稍微麻烦一部分了，例如针对大豆种子的蛋白质含量的监测，在进公务员行政职业能力测验定时先使用旋风磨进行种子研磨，马上使用凯式定氮仪来进行对粉末的蛋白质含量测定，使用旋风磨测定时，针对大豆中的蛋白质含量还有脂肪含量的影响均是比较的小，可以保证测定途中的准确度。

考马斯亮蓝染色法，也称Bradford检测法是现在灵敏度高的蛋白质测定方式。其早是在1976年由Bradford按照蛋白质与染料相结合的原理建立。

1.Bradford法原理

在酸性分析试剂溶液中，染料考马斯亮蓝 G-250与蛋白质结合的主要是阴离子形式的蓝色，其大吸收峰 （λmax）位置在590nm，形成的复合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系。因为这个原因，通过测定染料的蓝色离子态可以定量测定蛋白质，一般测定595nm下的吸光度