制作测序报告需要注意什么-华宇考试网

本文主要针对制作测序报告需要注意什么和测序要求等几个问题进行详细讲解，大家可以通过阅读这篇文章对制作测序报告需要注意什么有一个初步认识，对于今年数据还未公布且时效性较强或政策频繁变动的内容，也可以通过阅览本文做一个参考了解，希望本篇文章能对你有所帮助。

制作测序报告需要大家特别注意什么？

制作测序报告要注意，1. 测序所用模板DNA的量大多数情况下按下表要求加入：因为超螺旋质粒出现的信号比松驰的线性双链DNA弱，因为这个原因使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一部分。

模板种类/长度模板量

200 bp（PCR产物）16 ng（120 fmol）

3000-5000 bp（超螺旋质粒DNA）4 mg（2 pmol）

48 000 bp（λ粘粒DNA）1 mg（31 fmol）

2. 计算与4.5 pmol 相当的引物纳克数可用以下大多数情况下公式：

4.5 pmol=1.5 ng×n，这当中n为引物碱基数

计算与1 pmol 相当的引物微克数可用以下大多数情况下公式：

dsDNA：1 pmol=（6.6×10-4 mg）×n，这当中n为模板碱基对数

ssDNA：1 pmol=（3.3×10-4 mg）×n，这当中n为模板碱基数

3. 为阻止TaqDNA聚合酶延伸非特异性退火引物，热循环仪一定要预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不涵盖变温时间。假设你没办法确定使用哪种模式，建议从模式1启动。

模式1：适用于引物24碱基或GC含量百分之50

95℃2分钟。然后：95℃30秒（变性），42℃30秒（退火），70℃1分钟（延伸）。

模式2：适用于≥24碱基或略短的GC含量≥百分之50的引物。

95℃2分钟。然后：95℃30秒（变性），70℃30秒（退火/延伸）。

4. 在加入终止溶液后面样品可以在4℃保存过夜。

5. 水的质量针对染色的成功非常重要。超纯水（NANOpureR或Milli-QR的水）或双蒸水可取得很好的效果，假设水中有杂质，则低分子量条带可能没办法产生。

6. 碳酸钠也很重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠很好，如Fisher和KodakACS试剂级碳酸钠，大多数情况下可取得很好的结果。

转录组测序怎么选择材料？

1.植物组织：植物组织大多数情况下要求重量大于 4g。第一我们要备好液氮预冷的无酶管，并做好取样器械的消毒和去RNA酶处理，尽可能选取新鲜幼嫩、生长旺盛部位的样本进行快速采集，然后用RNase-free水对样品表面进行迅速的清洗，吸干表面液体后面放入无酶管中液氮速冻（时间不要太短哦），待彻底冷冻后，转移至-80℃冰箱保存。

2.动物组织：送样的重量大多数情况下要求在 2g以上。若在实验室中取样，做好器械的消毒和去RNA酶处理的前期工作后，快速进行取样。取下的样品用RNase-free水快速进行冲洗，吸干表面水分，放入预先放置在液氮中预冷的无酶管中，速冻不短的一个时期，转入-80℃冰箱保存；针对野外采样，没办法带上液氮等情形时，可以使用RNA保护剂。用RNase-free水对样品表面进行迅速清洗，然后快速切割成规定的大小（约黄豆粒），将样品完全浸没在RNA保护剂中，可以置于4℃中过夜（使保护剂渗透进组织中），转移至-80℃冰箱保存。

3.细胞样品：转录组测序中，细胞一定要达到足够的数量，以保证抽提的RNA的量。故此，针对培养的细胞系，第一要确定细胞数量（建议5×10^6以上）。第一对收集好的细胞用1×PBS清洗几遍，贴壁培养的先用少量胰酶消化一下（要记住不要消化过度），离心，弃PBS，加入适量的Trizol裂解液并反复吹打混匀，直至形成清亮透明的液体，转移至无酶管中，放-80℃冰箱保存。细胞量很少，可以联系我们的技术同事，来针对性给出合理化建议以便RNA抽提。

4.血液样品：血液样本大多数情况下要求2ml以上。当然我们要区分全血、血浆还是血清，不一样的样本因为自己特性不一样需区别对待。

全血样品记得一定要用抗凝采血管采集（不推荐肝素抗凝管，可用EDTA、柠檬酸钠抗凝剂的抗凝管），采血后轻轻倒转采血管混合4~5次，使抗凝剂与血液混匀。将采集好的全血迅速转移至独自的冻存管或离心管，根据每250ul/管分装，加750ul(即三倍体积)的Trizol LS（家禽、鱼类等红细胞有核物种，根据 1:8 或 1:10 比例添加 Trizol LS/Trizol），混匀。液氮速冻后，放-80℃冰箱保存。每个环节尽量的迅速完成，不要RNA的降解。