凝胶染色剂有哪些，sds电泳考马斯亮蓝染色

凝胶染色剂有什么？

琼脂糖凝胶电泳的染料有不少种,最近这些年较经常会用到的有：



EB-溴乙锭,EB有很大毒性,可致癌,故此，使耗费时长一定要万分小心.EB染色的背景很强.



SYBR Green-也叫荧光绿如蓝,低毒性,但检测灵敏度没有EB高.



GelRed-号称无毒,无皮肤渗入型,有伤口就不好说了.背景荧光弱,但加多了容易产生拖带.因为在市场上价格非常高,故此，有产生不少仿冒货,买时要擦亮眼睛.

(一)标准考马斯亮蓝染色法

(1)电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮蓝R-250(溶解于百分之50甲醇和百分之10乙酸中)；

(2)室温下振摇温育4h至过夜；

(3)去除染色液，收集保存可重复使用20-40次：

(4)依次在25%甲醇和7.5%乙酸中室温振摇下脱色。灵敏度为0.1-0.5ug蛋白/每条带。注：使用加热的染色液或脱色液可以缩短染色或脱色时间。将染色液或脱色液在微波炉或水浴中加热，(大概50-60℃)，染色时间可缩短至20min,脱色时间约 1-2h。

(二)迅速考马斯亮蓝染色法

(1)电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮蓝R-250(溶解于百分之50三lv乙酸中)；

(2)室温下振摇温育20min；

(3)去除染色液，收集保存可重复使用多次；

(4)加入数倍体积的脱色液(25%甲醇、7%乙酸)室温振摇下脱色。必要时可更改替换脱色液。灵敏度为1.0ug蛋白/每条带。

(三)凝胶铵银染色法

(1)电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的百分之50乙醇和百分之10乙酸，振摇30min至过夜；

(2)去除百分之50乙醇和百分之10乙酸，用去离子水清洗凝胶。加入百分之20乙醇, 室温振摇30min；

(3)去除百分之20乙醇，再加5倍体积的百分之20乙醇，室温振摇30min；

(4)去除百分之20乙醇，将凝胶转入通风柜内，加入5倍体积的用去离子水配制的5%戊2醛，室温振摇30min；

(5)去除戊2醛，用去离子水清洗凝胶。加入5倍体积的百分之20乙醇，室温振摇20min；

(6)去除百分之20乙醇，重复（6）两次；

(7)去除百分之20乙醇，用去离子水清洗凝胶。再加入5倍体积的用去离子水，室温温育10min；

(8)去除去离子水，加入4倍体积新鲜配制的氨-水/银溶液，室温振摇30min。配制100ml：加1.4ml 14.8mol/L氢氧化铵到100ml水中，再加入190ul　10mol/L氢氧-化钠；放置涡旋器上缓缓加入1ml新鲜配制的硝-酸银溶液(0.8g硝-酸银/ml水)，直至产生沉淀物，但很快溶解；

(9)去除氨-水/银溶液，用去离子水清洗凝胶20min以上，其间更改替换水数次；

(10)去除水，加入5倍体积新鲜配制的0.005%柠檬酸，0.019%的甲醛。轻柔混匀，数分钟内条带即显现出。当背景启动变化时，去除显影剂，用用去离子水清洗凝胶。在百分之10乙酸和百分之20乙醇中温育凝胶，以终止反应。灵敏度为1－10ng蛋白/每条带。

注：操作时，应戴手套并使用洁净的玻璃器皿，避免污染，影响反应的灵敏度。

(四)凝胶中性银染色法

(1)电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的百分之30乙醇和百分之10乙酸，振摇30min至过夜；

(2)去除乙醇/乙酸溶液，加入5倍体积的百分之30乙醇, 室温振摇30min；

(3)去除乙醇，再加5倍体积的百分之30乙醇，室温振摇30min；

(4)去除乙醇，加入10倍体积的去离子水，室温振摇10min；重复用去离子水清洗两次；

(5)去除去离子水，加入4倍体积新鲜配制的0.1%硝-酸银溶液(用室温下贮存于棕色瓶内的百分之20原液稀释而得)，室温振摇30min；

(6)去除硝-酸银溶液，用去离子水清洗凝胶20s；

(7)去除水，加入5倍体积的2.5%碳酸钠和 0.02%的甲醛(pH4.0),室温振摇温育，数分钟内条带即显现出。当背景启动变黑时，停止温育；

(8)在1%乙酸内清洗，停止反映。用去离子水清洗，更改替换数次，每一次10min；灵敏度为1－10ng蛋白/每条带。

(五)凝胶铜染色法凝胶铜染色法为考马斯亮蓝或银染色法的替代染色方式

将凝胶lv化铜溶液中温育，在Tris和SDS同时存在时可形成明显的白色不透明的沉淀物。蛋白条也还是清晰，留下一个多肽分离模式的附染图象。因为蛋白质未结合在凝胶上，可以通过EDTA去除Cu离子而得以洗脱，因而该方式特别合适需迅速定位蛋白条带用于免疫反应，或进一步进行蛋白质化学研究。其染色模式如同考马斯亮蓝或银染色法的凝胶，易进行拍照。

(1)电泳后，凝胶用蒸馏水短时清洗数次，每一次30s,勿洗过长时间；

(2)将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的0.3mol/L CuCl2；

(3)室温振摇５min，较厚的凝胶可一定程度上延长时间。当CuCl2 进入凝胶时，在不含蛋白的区域出现白色沉淀；

(4)用蒸馏水清洗数分钟，在黑色背景下观察结果。灵敏度为10-100ng蛋白/每条带(0.5mm厚的凝胶)或1ug蛋白/每条带(1mm厚的凝胶)。注：将凝胶在0.25mol/L EDTA、0.25mol/L Tris溶液中温育能够让铜染逆转

sds-page电泳后，用考马斯亮蓝直接染色和做wb的目标有何不一样？

一个是用肉眼直接观测目标蛋白的总体位置，一个是通过转膜，一抗二抗结合，ECL显影得到目标蛋白的位置及大小

电泳结束后的操作顺序？

第一关掉电源。电泳指的是带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动的情况。电泳结束时应先关掉电源。然后再取出玻璃板，取胶时动作要轻。使用考马斯亮蓝染液染色时可以在摇床上染色过夜，也可以在微波炉中加热煮沸进行染色。

电泳结束，应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态，并拨出电泳插头。

取出电泳板，进行染色或其他处理。电泳仪的使用方式需了解详细实验要求和设备操作手册，避免产生操作失误和安全问题。

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