分子生物学鉴定步骤，自动细菌培养及鉴定是什么意思

分子生物学鉴定步骤？

第一你要提出细菌的DNA。

方式请看下方具体内容：

1、液体培养及保种：从斜面上挑取菌苔于液体培养基中放摇床上震荡（转速160r/min）培养16小时。吸取菌液于1.5ml的经过灭菌的EP管中，再加甘油（30-百分之40）进行保种。（-80摄氏度保藏2年）

2、提取DNA（CTAB法）：

（1）取1.5ml菌液于1. 5ml离心管中，12023r/min离心2min，弃上清。

（2）向沉淀物中加入350ul双蒸水，重新悬浮沉淀。

（3）加入20ul百分之10SDS和3ul的蛋白酶K（20mg/ml），溶菌酶3ul，混匀，于50℃温育1h。

（4）加入50ul 5mol/L NaCl溶液，充分混匀，再加入50ul CTAB/NaCl溶液，混合后再65℃温育30min。

（6）冷却后加入等体积的酚(沉淀蛋白质)：氯仿：异戊醇（提高酚的作用）（25:24:1），小心上下颠倒混匀，12023r/min离心5min，将上清液转移到新的EP管，重复此步骤2-3次，直至分层界面无白色沉淀。

（7）加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），小心颠倒混匀，12023r/min离心5min将上清液转移到新的EP管。（纯化作用）

（8）加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，12023r/min离心15min弃上清。

（9）向离心管中加入75%乙醇，12023r/min离心5min洗涤DNA沉淀，小心弃上清，重复洗涤1次，弃上清将离心管倒置于吸水纸上，晾干。

（10）加入50ul（双蒸水）/ TE Buffer溶解DNA于4℃保存。

（11）电泳检测

6、PCR扩增：（细菌的通用引物为27F和1492R）将提获取到的DNA进行PCR扩增，电泳检测扩增得到的16S rDNA（假设菌类分明，条带清晰，PCR原液可直接送去测序，双向测通，得到测序序列后到NCBI的BLAST页面比对，得出鉴定结果）

7、酶切带型分型确定操作单元：将扩增产物用HhaI和HaeIII两种限制性内切酶进行酶切，电泳检测酶切产物，酶切带型一样的分为一个操作单元。

8、连接转化：从每一个操作单元中选取一株菌的16S rDNA进行连接实验。将连接产物转入感受态细胞中，将感受态细胞涂布于含有Amp的平板上，倒置培养12-16h。

9、克隆子挑选及PCR鉴定：从上一步的平板上挑取单菌落于含有Amp的液体培养基中震荡培养12h，以培养液为模板直接进行PCR扩增鉴定（1000-2023bp）。将含有目标片段的克隆子菌液低温保存。

10、测序：将含有目标片段的克隆子菌液送去测序。

11、序列拼接：运用DNAMAN软件对测序得到的序列进行拼接。

12、建树：对拼接得到的序列用Blast进行比对，后将比对得到的全部序列运用MEGA6建立系统发育树

第一你要提出细菌的DNA。方式请看下方具体内容：

1、液体培养及保种：从斜面上挑取菌苔于液体培养基中放摇床上震荡（转速160r/min）培养16小时。吸取菌液于1.5ml的经过灭菌的EP管中，再加甘油（30-百分之40）进行保种。（-80摄氏度保藏2年）

2、提取DNA（CTAB法）： （1）取1.5ml菌液于1. 5ml离心管中，12023r/min离心2min，弃上清。 （2）向沉淀物中加入350ul双蒸水，重新悬浮沉淀。

（3）加入20ul百分之10SDS和3ul的蛋白酶K（20mg/ml），溶菌酶3ul，混匀，于50℃温育1h。

（4）加入50ul 5mol/L NaCl溶液，充分混匀，再加入50ul CTAB/NaCl溶液，混合后再65℃温育30min。

（5）冷却后加入等体积的酚(沉淀蛋白质)：氯仿：异戊醇（提高酚的作用）（25:24:1），小心上下颠倒混匀，12023r/min离心5min，将上清液转移到新的EP管，重复此步骤2-3次，直至分层界面无白色沉淀。

（6）加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），小心颠倒混匀，12023r/min离心5min将上清液转移到新的EP管。（纯化作用）

（7）加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，12023r/min离心15min弃上清。

（8）向离心管中加入75%乙醇，12023r/min离心5min洗涤DNA沉淀，小心弃上清，重复洗涤1次，弃上清将离心管倒置于吸水纸上，晾干。

（9）加入50ul（双蒸水）/ TE Buffer溶解DNA于4℃保存。

（10）电泳检测6、PCR扩增：（细菌的通用引物为27F和1492R）将提获取到的DNA进行PCR扩增，电泳检测扩增得到的16S rDNA（假设菌类分明，条带清晰，PCR原液可直接送去测序，双向测通，得到测序序列后到NCBI的BLAST页面比对，得出鉴定结果）。

自动细菌培养及鉴定是什么？

自动细菌培养及鉴定是一种自动化、高通量的微生物检测技术，可以达到样品的高效在线处理和细菌的迅速检测。它一般使用根据微孔板的检测系统，将样品涂布于微孔板上，并通过微孔板封闭的微小孔隙进行培养和检测。随着细菌生长，它们会分解基质并出现二氧化碳和酸，这些变化可以被微孔板上的感应器监测。这些感应器可以自动测量和记录培养液的变化，并按照先前确定的细菌鉴定模式来识别细菌菌株。

自动细菌培养及鉴定技术具有高效、准确、迅速的特点，可在短时间内自动化地完成非常多的微生物检测和鉴定工作，针对实验室的微生物研究和临床微生物诊断等方面有着广泛的应用。

自动细菌培养及鉴定是一种先进的细菌检测技术，它利用仪器自动完成细菌培养、鉴定和药敏试验等多项操作，大大提升了检测效率和准确性。

详细操作步骤请看下方具体内容：

1. 从样本中取出细菌，一般是通过采样、培养等方法取得。

2. 将样本送入自动细菌培养及鉴定仪。

3. 仪器按照预设程序自动进行培养，按照时间、温度、湿度等控制条件，促使样本中的细菌生长繁殖。

4. 培养成功后，仪器会自动进行鉴定，根据细菌形态、生理生化特点等进行分类。

5. 按照鉴定结果，进行药敏试验，确定对应的抗菌药物是不是有效，以此为疾病诊断和治疗提供依据。

使用自动细菌培养及鉴定技术的优势在于它可以大幅度提升细菌检测效率，减轻检测人员的工作压力，还因为采取了先进的技术和设备，减少了人工干扰可能导致的误差，提升了鉴定结果的准确性。

用显微镜观察细菌的步骤？

观察细菌，差不多都是染色后再进行观察。其实就是常说的制片的过程要注意。 观察步骤就是为了让用100X油镜进行观察的步骤。注意聚光镜光阑与镜头数值孔径的匹配，和光强控制基本就行了。

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