酶免疫技术中酶和酶作用底物是怎么样的呢？

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酶和酶作用底物

（一）酶的要求： 

一个酶蛋白分子每分钟可催化10 3 ～10 4 个底物分子转变成有色产物。用于标记的酶应符合：

1.酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。

2.酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。

3.作用专一性强 ，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。用于均相酶免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后，酶活性可出现抑制或激活。

4.易与抗体或抗原偶联 ，标记后酶活性保持稳定，且不影响 标记抗原与抗体的免疫反应性 。

5.酶、辅助因子及其底物对人体无害 ，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。

（二）常用的酶

1.辣根过氧化物酶（HRP）：

目前酶联免疫吸附试验中应用广泛 的标记用酶。

由无色的糖蛋白(主酶)和亚铁血红蛋白(辅基)结合而成的复合物。

辅基是酶活性基团 ，而主酶则与酶活性无关 ，HRP的纯度用RZ(HRP分别在403nm和275nm处的吸光度比值)表示，RZ值应大于3.0 。

RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量 ，并非表示HRP制剂的真正纯度，而且RZ值高的HRP并不意味着酶活性也高，RZ值与酶活性无关 。

酶活性以单位U表示： 即1分钟将1μmol底物转化为产物所需的酶量。酶变性后，RZ值不变但活性降低 ，因此使用酶制剂时，酶活性单位比RZ值更为重要。

2.碱性磷酸酶（AP）：

大肠杆菌来源 的AP分子量80kD，酶作用适pH为8.0 ;小牛肠黏膜AP 分子量为100kD，适pH为9.6 ;后一种AP的活性高 于前者。

3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）：

β-Gal来源于大肠杆菌。因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标志物在测定时不易受到内源性酶的干扰 ，从而提高特异性，被用于均相酶免疫测定 。

（三）常用的底物

1.HRP的底物

（1）邻苯二胺（OPD）：

 是HRP为敏感的色原底物之一。OPD在HRP的作用下显橙黄色 ，加强酸 如硫酸或盐酸终止反应后呈棕黄色 ，大吸收峰在492nm 波长。OPD应用液稳定性差，易变色，需新配制后在1小时 内使用，显色反应过程需避光 ，而且具有致癌 性。

（2）四甲基联苯胺（TMB）：

 TMB经HRP作用后变为蓝色，加入硫酸终止 反应后变为黄色 ，大吸收峰波长450nm。TMB稳定性好，成色无需避光 ，无致突变作用，是目前ELISA中应用广泛的底物 。缺点是水溶性差 。

(3)其他：

5-氨基水杨酸(5-ASA)和2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)。

2.AP的底物

常用对-硝基苯磷酸酯（p-NPP） ，p-NPP经AP作用后的产物为黄色 对硝基酚，大吸收峰波长为405nm。

3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）的底物

常用4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU），酶作用后，生成高强度荧光 物4-甲基伞形酮(4-MU)，其敏度性较HRP 高30～50倍，但测量时需用荧光计。

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