什么是考马斯亮蓝法（Bradford法），蛋白质染色的几种方法?

什么是考马斯亮蓝法（Bradford法）？

bradford法测定蛋白质含量的原理是考马斯亮蓝G250与蛋白质结合可以显色，用分光光度计在吸光度595nm处读数，通过标准蛋白与G250结合显色建立标准曲线，再加待测蛋白与G250结合显色后读数代入标准曲线测定蛋白质含量。不利原因主要是特殊蛋白的结构，缓冲液组分中有干扰试剂等。

蛋白质染色的几种方式？

蛋白质它可以跟不少试剂出现颜色的反应．比如在鸡蛋白溶液中滴入一滴的浓硝酸,则鸡蛋白溶液会呈黄色的，这个原理是因为蛋白质（含苯环结构）与浓硝酸出现了颜色反应.并且它还可以用双缩脲试剂对其进行检验,该试剂遇蛋白质变紫的。

经常会用到的蛋白质染色试剂分为已考马斯亮蓝为代表的有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。

这当中考马斯亮蓝染色法的应用较为广泛，现在将其与其他的蛋白质染色方式(主要是银染法)作一比较，帮各位考生更好地去选择适合的蛋白质染色方式。

蛋白质的染色经常会用到的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。

这当中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法(Coomasie brilliant blue，CBB)为代表，在蛋白质分析中经常会用到，但对低丰度蛋白质的显现较差；银染灵敏度虽高，却常与质谱不兼容；荧光染色以SYPRO试剂为主，蛋白质检测灵敏度高，能兼容质谱，但因为需配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵，未被作为常见方式使用；而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题。

因为这个原因，筛选简单方便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋白质组研究所需。

因为考马斯亮蓝染色法的广泛运用，近几年来就考马斯亮蓝染色法在提升其灵敏性方面研究者们作了不少改进，方式很多，评价不一。

我们在作双向凝胶电泳时，将经常会用到的几种考马斯亮蓝染色法及银染进行了比较，并就其染色影响原因作出分析。……具体资料请参考：on http://www.bio1000.com/experiment/protein/351913.html

Western中考马斯亮蓝的作用是什么？

考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因为这个原因可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右时间内达到平衡，完成反应十分快速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简单方便快捷，反应很灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL是一种经常会用到的微量蛋白质迅速测定方式。 考马斯亮蓝有G250和R250两种。这当中考马斯亮蓝G250因为与蛋白质的结合反应十分快速，经常会用到来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是，可以被洗脱下去，故此，可以用来对电泳条带染色。 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程 该方式用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超越0．2％影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。 1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50m195％乙醇，加入100ml浓磷酸，然后，用蒸馏水补充至200ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。 2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽可能使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，比如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。假设待测样本是未知的，也可以用抗体作为标准蛋白。一般在20ug—150ug／100ul当中绘制标准曲线。 3．将待测样本溶于100~1缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液一样(好用PBS)。 4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如产生沉淀，过滤除去。 5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30rain。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不可以超越30min． 6．按照标准曲线计算待测样本的浓度。

考马斯测定蛋白质含量时稀释倍数怎么定？

用考马斯亮蓝法时，稀释蛋白的倍数主要主要还是看标准曲线的情况。 例如用BSA作标准曲线，第一个点加入0.02mg/ml的BSA，其后依次增多为0.04、0.06、0.08、0.1mg/ml。既然如此那，需测定的蛋白质还要稀释到浓度在0.02~0.1mg/ml当中。

考马斯亮蓝法测蛋白质含量用到什么仪器？

蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，以此改变这些染料的光吸收。

在些基础上发展了蛋白质染色测定方式。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。现在广泛使用的染料是考马斯亮蓝。考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内满足比尔定律，可以在595nm处比色测定。2—5分钟即呈大光吸收，至少稳定1小时。在0.01—1.0 mg蛋白质/ml范围内都可以。该法操作简单方便快速，消耗样品量少，但不一样蛋白质当中差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定

考马斯亮蓝有几种类型？

蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，以此改变这些染料的光吸收。

在些基础上发展了蛋白质染色测定方式。

涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。

现在广泛使用的染料是考马斯亮蓝。

考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内满足比尔定律，可以在595nm处比色测定。

2—5分钟即呈大光吸收，至少稳定1小时。

在0.01—1.0 mg蛋白质/ml范围内都可以。

该法操作简单方便快速，消耗样品量少，但不一样蛋白质当中差异大，且标准曲线线性差。

高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。

缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。

考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定

考马斯亮蓝反应情况？

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量实验中，使用的水低要求是蒸馏水，更高精度要求可能会使用双蒸水。因为Bradford检测中要用的试剂配制，标准曲线的制作都要用到水。

假设不是为了让用蒸馏水，可能水里面会有一部分游离的离子或者电解质，会影响试剂配制的准确性，干扰实验结果。

而水中残留的有机物等可能会和考马斯亮蓝出现变色反应，这样制作的标准曲线会比实质上值偏高，致使后浓度检测的结果比实质上结果偏低。

双氧水使蛋白质变性后，加考马斯亮蓝测样品中蛋白含量会不会有影响？

有影响 考马斯亮蓝测定蛋白质的原理：考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。当用双氧水作用蛋白质后，蛋白质结构会出现变化，致使疏水区的外漏，原来的水化膜被破坏，这样再加入考马斯亮蓝，他与蛋白质的结合位点增多，会使测定值偏大，不可以正确测出蛋白质的浓度了。

以上就是对什么是考马斯亮蓝法（Bradford法），蛋白质染色的几种方法?的详细介绍，点击博客网站司法考试了解更多司法考试报名条件及考试报名时间等考情信息，司法考试资料点击下方百度云网盘可免费下载。

司法考试复习资料下载