什么是考马斯亮蓝法（Bradford法），考马斯亮蓝法测定范围

bradford法测定蛋白质含量的原理是考马斯亮蓝G250与蛋白质结合可以显色，用分光光度计在吸光度595nm处读数，通过标准蛋白与G250结合显色建立标准曲线，再加待测蛋白与G250结合显色后读数代入标准曲线测定蛋白质含量。不利原因主要是特殊蛋白的结构，缓冲液组分中有干扰试剂等。

考马斯亮蓝显色法测定植物蛋白质含量，显色反应灵敏，大吸收波长是595nm，而考马斯亮蓝的大吸收波长是488nm，不干扰测定结果。

考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因为这个原因可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右时间内达到平衡，完成反应十分快速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简单方便快捷，反应很灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL是一种经常会用到的微量蛋白质迅速测定方式。 考马斯亮蓝有G250和R250两种。这当中考马斯亮蓝G250因为与蛋白质的结合反应十分快速，经常会用到来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是，可以被洗脱下去，故此，可以用来对电泳条带染色。 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程 该方式用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超越0．2％影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。 1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50m195％乙醇，加入100ml浓磷酸，然后，用蒸馏水补充至200ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。 2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽可能使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，比如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。假设待测样本是未知的，也可以用抗体作为标准蛋白。一般在20ug—150ug／100ul当中绘制标准曲线。 3．将待测样本溶于100~1缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液一样(好用PBS)。 4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如产生沉淀，过滤除去。 5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30rain。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不可以超越30min． 6．按照标准曲线计算待测样本的浓度。

R250不可以用来测蛋白质浓度的，G250用来测蛋白质浓度100mg考马斯亮蓝G-250溶于50 ml 95%乙醇，加入100 ml磷酸然后补加水至1 L，Whatman1号滤纸过滤。

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量实验中，使用的水低要求是蒸馏水，更高精度要求可能会使用双蒸水。因为Bradford检测中要用的试剂配制，标准曲线的制作都要用到水。

考马斯亮蓝G250法测蛋白质含量比其他方式的优点是：

1.蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右时间内达到平衡，完成反应十分快速；

2.其结合物在室温下1h内保持稳定。

3.该法试剂配制简单，操作简单方便快捷，反应很灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1,000μg/mL是一种经常会用到的微量蛋白质迅速测定方式。 考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因为这个原因可用于蛋白质的定量测定。